平衡透析法測定血漿蛋白結合率原理

藥物血漿蛋白結合率（Plasma Protein Binding, PPB）即血液中與蛋白結合的藥物占總藥量的百分數，可以反映藥物與血漿蛋白結合的程度。藥物血漿蛋白結合率是藥物在動物體內重要的藥理學參數之一，影響著藥物體內游離濃度進而影響藥物的分布與排泄。藥物在進入血液后與血漿蛋白會有不同程度結合，血液中游離藥物的比例會影響其在體內吸收、分布、代謝和排泄的過程，與血漿蛋白結合的藥物可能會有更長的半衰期和清除速率，因此測定血漿蛋白結合率對于理解化合物的活性以及組織分布有很重要的參考意義。

1 結合蛋白類型

血漿蛋白主要作為載體負責各類外源性和內源性分子在循環(huán)系統(tǒng)內的轉運。其中參與小分子藥物結合的主要有白蛋白、α-1-酸性糖蛋白（AAG）、球蛋白和脂蛋白，主要以白蛋白和α-1-酸性糖蛋白（AAG）為主。藥物與蛋白的結合強弱主要與藥物-蛋白親和力、蛋白豐度相關。

2 血漿蛋白結合率常用測定方法

目前常用于藥物血漿蛋白結合率測定的常用方法包括平衡透析法（Equilibrium Dialysis），超濾法（Utrafiltration Method），超速離心法（Ultracentrifugation Method），凝膠過濾法（Gel filtration）等。 其中，平衡透析法是基于藥物結合的平衡原理來測定藥物游離濃度的方法，也是研究藥物血漿蛋白結合率的經典方法。超濾法使用濾膜分立自由的藥物和結合蛋白的藥物，時間短，但確定點是藥物容易結合到超濾過程使用的器械上，從而影響檢測結果。平衡透析法雖然比超濾法耗時多一些，但它使用teflon鍍層的平衡裝置，能大大減少藥物的非特異性結合，得到更精確的結果。目前，平衡透析法已有96孔板的高通量測試形式，可以實現同時測試大量候選藥物的蛋白結合率。

平衡透析法

常用血漿：大鼠血漿，小鼠血漿，比格犬血漿，猴血漿，人血漿

分析方法：LC-MS/MS，GC-MS等

各種藥物以一定的比率與血漿蛋白結合之后，在血漿中會同時存在結合型與游離型兩種類型，游離性藥物具有藥物活性。藥物與血漿蛋白結合會成為結合型藥物，暫時失去藥理活性，并且儲存于血液中，起到藥庫的作用，對于藥物作用及其維持時間長短具有重要的意義。一般蛋白結合率高的藥物體內消除慢，作用維持時間長，藥效平穩(wěn)。結合率低的藥物體內消除快，同時作用時間短，藥效有很大的波動。

平衡透析法測定血漿蛋白結合率是用透析膜將蛋白質溶液與緩沖液分隔開，建立在兩者之間的一種平衡狀態(tài)，只有分子量小的藥物小分子可以通過。透析的動力是擴散壓，擴散壓是由橫跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度與膜的厚度、透析的小分子溶質在膜兩邊的濃度梯度及透析溫度等因素有關。平衡透析法能夠直接測出為與蛋白結合的藥物小分子的數量，這是分析蛋白與小分子物質結合的關鍵，從而能夠求出結合位點數及結合常數。

圖1：分隔示意圖

如圖所示，利用匯智和源平衡透析膜將左右兩室進行分隔，膜左側加入含藥的待測藥物，膜右側加入空白緩沖液，未被結合的游離藥物可以自由穿過透析膜，孵育一定時間后兩側達到平衡，游離藥物濃度相等，通過HPLC或LC-MS/MS等方法測定兩側藥物濃度，利用公式即可計算得到血漿蛋白結合率。這種透析膜只允許特定分子量的小分子通過，而阻止蛋白大分子通過。

平衡透析法在測定藥物血漿蛋白結合率具有操作簡單、溫度易于控制、PH值可調、設備成本低廉等優(yōu)點。但是同時存在達成平衡時間較長、溶液體積會變化，且透析時間過長可能會造成由加熱或代謝引起的被測物質的降解等缺點。因此在利用平衡透析法測定藥物血漿蛋白結合率，或者藥物與蛋白質相互作用時需要與其他的一些方法聯用，才能獲得更準確的作用信息。一般只有血漿蛋白結合率高，分布容積小，消除慢以及治療指數低的藥物在臨床上的這種相互作用才有意義。

匯智和源/匯智泰康ADME服務項目
血漿蛋白結合率測定

代謝穩(wěn)定性研究
肝微粒體代謝實驗
肝細胞代謝穩(wěn)定性試驗
代謝表型研究
代謝產物鑒定
代謝途徑鑒定
種屬比較研究
CYPP450酶抑制實驗（常用CYP450酶包括CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2C8，CYP2C9，CYP2C19，CYP2D6，CYP2E1，CYP3A4等）
CYP450酶誘導實驗
血漿穩(wěn)定性試驗
跨膜轉運試驗
藥物-藥物相互作用
毒理學研究

4 血漿蛋白結合試驗檢測試劑盒

匯智和源/匯智泰康針對血漿蛋白結合率測定試驗研發(fā)針對性的平衡透析裝置，平衡透析裝置包括96個透析池和透析池之間的透析膜組成，可以同時對多個樣品進行透析測定，確定游離化合物比例。透析膜（半透膜）選用高分子膜，孔徑可根據客戶需求定制。

產品：

血漿蛋白結合平衡透析裝置
血漿蛋白結合試劑盒
血漿蛋白結合試劑盒-猴血漿
血漿蛋白結合試劑盒-比格犬血漿
血漿蛋白結合試劑盒-大鼠血漿
血漿蛋白結合試劑盒-小鼠血漿

試劑盒組分：

①透析膜

②不同動物血漿

③PBS緩沖液

注意事項：

①影響血漿蛋白結合率測定的因素很多，如溶解度、溫度、非特異性結合、酯酶代謝等，需要根據化合物特征，結合研究目的選擇合適的測定方法進行實驗。

②如果有的藥物具有很高的蛋白結合能力，試驗條件的微小偏差可能會使試驗結果出現較大偏差，從而大大提高血液中藥物的濃度而引起毒性。

圖2：平衡透析裝置

圖3：半透膜