Ames試驗建立以來，在全球范圍內(nèi)應(yīng)用了近五十年，是評價化合物致突變性的一種經(jīng)典方法。隨著人們對Ames試驗認(rèn)同度的不斷提高，Ames試驗已成為遺傳毒理學(xué)的一個檢測項目，廣泛應(yīng)用于食品、藥品、化學(xué)品、化妝品、農(nóng)藥、醫(yī)療器械、消毒產(chǎn)品、環(huán)境等多個領(lǐng)域。IPHASE/匯智和源綜合多年Ames試劑盒研發(fā)和技術(shù)服務(wù)的經(jīng)驗，將試驗過程和試劑盒使用中的常見問題進(jìn)行了總結(jié)，供大家參考。

第一題    要開展Ames試驗，如何選擇溶媒/賦形劑？

答：不同劑量濃度樣品的制備是開展Ames試驗的前提，制備符合試驗要求的樣品也有一些行業(yè)要求需要遵守。第一,溶媒/賦形劑的選擇原則是其不與受試物發(fā)生反應(yīng)，對菌株和S9沒有毒性，沒有誘變性；第二，選蒸餾水，對于不溶于水的受試物可選擇其它溶媒/賦形劑，若受試物對水不穩(wěn)定，應(yīng)選用不含水的有機(jī)溶劑或賦形劑；第三，若選用有機(jī)溶劑作為溶媒，選DMSO，也可選其它溶媒，若選用的是不常用的溶媒或賦形劑，應(yīng)有資料說明其理由，且若選用有機(jī)溶劑做為溶媒，每平板最高添加量不超過0.1mL。

第二題    Ames試驗的最高劑量組應(yīng)如何確定？

答：Ames試驗最高劑量組的確定取決于受試物對試驗菌株的毒性和受試物的溶解度。建議先進(jìn)行預(yù)實驗測定受試樣品的毒性和溶解度，應(yīng)根據(jù)受試樣品對細(xì)菌的毒性和在配制的最終混合物種的溶解度確定受試樣品的最高劑量組。可將回變菌落數(shù)的減少、背景菌苔體積變小或處理后細(xì)菌存活率降低等作為細(xì)菌毒性的指征。

第三題     Ames試驗組別如何設(shè)置？

答：Ames試驗通常需要包含未處理對照組（自發(fā)對照組）、陽性對照組（標(biāo)準(zhǔn)誘變劑對照組）溶媒對照組和樣品劑量組四個組別的試驗。需要注意的是，若溶解樣品使用的溶媒和標(biāo)準(zhǔn)誘變劑使用的溶媒不一致時，還需加做DMSO的對照，且樣品劑量組數(shù)量不同領(lǐng)域的要求會存在一定差異，需關(guān)注具體參照的標(biāo)準(zhǔn)或?qū)t。

第四題    為什么要在有和沒有代謝活化系統(tǒng)的情況下試驗？

答：代謝活化系統(tǒng)是誘導(dǎo)S9和輔因子的混合溶液。誘導(dǎo)S9本身是經(jīng)藥物誘導(dǎo)后的動物肝臟的組分，誘導(dǎo)的目的是讓酶活得以放大。加代謝活化系統(tǒng)組評估的是代謝產(chǎn)物的遺傳毒性，而不加代謝活化系統(tǒng)組評估的是原藥的遺傳毒性。對于未知化合物，因不確定是其自身，還是其代謝產(chǎn)物會有遺傳毒性，故需在這兩種情況下同時進(jìn)行試驗。

第五題    Ames試劑盒可以檢測幾個樣品？

答：Ames試劑盒可完成一個樣品的Ames檢測。Ames試劑盒（5菌版/正式試驗）規(guī)格為250皿/盒，可在有和無代謝活化系統(tǒng)、5個菌株、三個平行的情況下進(jìn)行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測；Ames試劑盒（2菌版/預(yù)實驗）規(guī)格為150皿/盒，可在有和無代謝活化系統(tǒng)、2個菌株、三個平行的情況下進(jìn)行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的8個劑量組的遺傳毒性檢測；微量波動Ames試劑盒的規(guī)格我96孔*16板，可在有和無代謝活化系統(tǒng)、2個菌株、48孔/處理組的情況下進(jìn)行對照組（未處理對照組、溶媒對照組、陽性對照組）和樣品的5個劑量組的遺傳毒性檢測。

第六題    試劑盒中菌株可不可以傳代培養(yǎng)？

答：不建議對試劑盒中的菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)。原因主要有以下三點：第一，Ames試劑盒中菌株是以凍存菌液形式提供，可滿足Ames試驗要求，收到貨后無需進(jìn)行其它處理，可直接用于試驗；第二，因Ames試劑盒中菌株均為營養(yǎng)缺陷型菌株，頻繁處理可能使得其某些特性丟失；第三，Ames試驗對菌株不但有濃度的要求，而且有自發(fā)和陽性突變菌落數(shù)的要求，國標(biāo)或指導(dǎo)原則中雖然寫的較為簡單，但真正要達(dá)到其要求卻很難。

第七題    Ames試劑盒是否可分多次去使用？

答：Ames試劑盒試劑盒中菌株和S9復(fù)合物不建議反復(fù)凍融使用，如需分次多次試驗，建議按照菌株分次進(jìn)行。Ames試劑盒中菌株為營養(yǎng)缺陷型菌株，且以凍存菌液形式提供，反復(fù)凍融一方面可能會導(dǎo)致其某些特性丟失，另一方面也會直接導(dǎo)致自發(fā)回變數(shù)和陽性誘變劑回變數(shù)達(dá)不到標(biāo)準(zhǔn)或指導(dǎo)原則要求。S9復(fù)合物在Ames試驗中是作為代謝活化系統(tǒng)，而發(fā)生代謝主要是酶的參與，反復(fù)凍融會導(dǎo)致酶活降低，可能會導(dǎo)致試驗結(jié)果的假陰性。

第八題    當(dāng)受試物（如某些抗生素）對細(xì)菌有高毒性時是否還需進(jìn)行Ames試驗？有沒有其它驗證方法？

答：當(dāng)受試物對細(xì)菌有高毒性時，仍應(yīng)進(jìn)行Ames試驗，因為致突變性可能出現(xiàn)在較低的、毒性較小的濃度。為了減少具有潛在遺傳毒性的化合物產(chǎn)生假陰性結(jié)果的風(fēng)險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合。任何一項遺傳毒性試驗中的陽性結(jié)果并不一定能說明化合物對人類真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。故可以加做其它試驗，如基因突變試驗、染色體畸變試驗。

第九題    在實驗的過程中，可能會因為化合物的溶解性不好，導(dǎo)致無法區(qū)分是菌落還是沉淀，該如何處理？

答：常規(guī)的要求是平皿中可以有未溶解的化合物，但是沉淀的存在不能影響到菌落計數(shù)。若這種情況無法避免，可以培養(yǎng)48h后先進(jìn)行一次菌落觀察和計數(shù)，并繼續(xù)培養(yǎng)至72h，若生長則可判定為菌落，也可挑取菌落接種至培養(yǎng)基培養(yǎng)觀察是否生長。

第十題    試驗過程中加S9組比不加S9組菌落數(shù)要高，是否正常？

答：這種情況屬正常現(xiàn)象，但即使偏高也會在國標(biāo)或?qū)t的要求范圍內(nèi)。可能是因為肝S9本身有痕量的氨基酸成分，可為會菌提供營養(yǎng)。

十一題    受試物濃度低未檢出遺傳毒性還是本身無遺傳毒性？該如何判斷？

答：一方面，Ames試驗的要求是，若試驗結(jié)果為陰性，需進(jìn)行驗證，即需改變試驗條件進(jìn)行重復(fù)試驗。另一方面，為了減少假陰性結(jié)果的風(fēng)險，遺傳毒性的研究通常需要多個試驗的組合，可補(bǔ)做基因突變、染色體畸變、微核等其它試驗。

十二題    醫(yī)療器械：浸提溶劑為什么選擇水？按照標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該選擇生理鹽水或DMSO。

答：關(guān)于醫(yī)療器械的浸提屬于樣品前處理的過程，試劑盒中未提供，需自行進(jìn)行準(zhǔn)備。試劑盒適用于多個領(lǐng)域的Ames檢測，具體到每個領(lǐng)域，可能會有一定差異。

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